在傳統的小(xiǎo)分子藥物研發中，決定靶點特異性與DMPK（分布、代謝(xiè)和(hé)藥代動力學）的結構特征往往密不可分，很(hěn)難相互獨立的進行設計(jì)和(hé)優化。與之不同，寡核苷酸類藥物的藥效團和(hé)藥代動力學性質在理(lǐ)論上(shàng)可以分别優化，這(zhè)是因爲寡核苷酸類藥物的核苷序列直接決定前者，而其磷酸酯骨架的化學性質很(hěn)大(dà)程度上(shàng)影響後者。目前，寡核苷酸類藥物有超過155項正在進行的臨床試驗，并已有多個獲批上(shàng)市的藥物，其中大(dà)部分都含有修飾的磷酸酯骨架。遺憾的是，盡管有機合成的進步對(duì)現(xiàn)代藥物化學的發展産生了(le)深遠的影響，但(dàn)是随着寡核苷酸序列和(hé)可能(néng)的磷酸酯骨架的範圍擴大(dà)，寡核苷酸合成的基本化學卻鮮有重大(dà)進步。如圖1所示，一段含有四種不同磷基連接結構以及多種糖骨架的嵌合寡核苷酸序列，如果使用(yòng)已有方法合成，所面臨的巨大(dà)困難也(yě)從(cóng)某種程度上(shàng)凸顯了(le)現(xiàn)有方法的局限性，理(lǐ)想中可以随意地以任何順序安裝更廣泛的組合和(hé)變化就顯得更加遙不可及。如此說來(lái)，寡核苷酸的商業化，更具體地說，廣受期待的硫代磷酸酯反義寡核苷酸（PS-ASO）的商業化面臨着重大(dà)挑戰。2018年，美(měi)國斯克裏普斯研究所（The Scripps Research Institute，TSRI）的Phil S. Baran教授與制藥巨頭百時(shí)美(měi)施貴寶（Bristol-Myers Squibb，BMS）的Ivar M. McDonald、Martin Eastgate、Michael Schmidt等研究者合作(zuò)發展了(le)一種基于P(V)的磷硫試劑（稱爲PSI或ψ）來(lái)解決立體純硫代磷酸酯（R-PS和(hé)S-PS，主要在DNA環境下(xià)）寡核苷酸的合成問題（Science, 2018, 361, 1234–1238，點擊閱讀詳細）。然而，這(zhè)項初步研究也(yě)有尚未解決的問題，比如其他(tā)類型磷酸酯骨架連接結構如二硫代磷酸酯和(hé)天然磷酸二酯的安裝，如鎖核酸（LNA）的其他(tā)糖化學，以及對(duì)現(xiàn)代自(zì)動化合成的适用(yòng)性。解決這(zhè)些(xiē)問題，要面對(duì)不少挑戰，比如：1）P(V)試劑曾被認爲反應速率過于緩慢，無法與P(III)歧化相競争；2）鳥嘌呤和(hé)胸腺嘧啶堿基的影響會(huì)導緻不同的化學選擇性；3）使用(yòng)現(xiàn)有基于P(III)的試劑來(lái)安裝二硫代磷酸酯連接結構并不理(lǐ)想；4）當前修飾磷酸酯骨架的方法步驟複雜(zá)，存在氧化與脫保護以及産物分離等問題。鑒于此，開(kāi)發一種高(gāo)度選擇性和(hé)兼容性的自(zì)動化寡核苷酸合成方法就顯得尤爲重要，會(huì)對(duì)寡核苷酸類藥物的研發和(hé)商業化産生深遠影響。在此前工(gōng)作(zuò)基礎上(shàng)，Baran教授等人近日再獲重要進展。通過利用(yòng)ψ2（3）、rac-ψ（4）和(hé)ψO（5）三種新試劑，并與已報(bào)道(dào)的[(+)-ψ, (+)-2]和(hé)[(−)-ψ, (−)-2]體系相結合，他(tā)們開(kāi)發了(le)一種完全不同于P(III)基寡核苷酸合成的通用(yòng)P(V)平台，實現(xiàn)了(le)特定寡核苷酸序列的任意受控合成（圖1C）。該方法不僅能(néng)夠減少保護基化學的依賴、特殊試劑、氧化試劑等多個方面的問題，而且還去掉了(le)标準固相寡核苷酸合成（SPOS）方案中的一個完整步驟（即磷氧化過程）。相關成果于近日發表在Science上(shàng)。
相比于ψ2與ψO的合成，rac-ψ的合成相對(duì)簡單，以環氧環己烷爲原料類比ψ即可獲得。爲此，作(zuò)者對(duì)含有二硫代磷酸酯ψ2和(hé)天然磷酸二酯的ψO試劑的合成進行了(le)探索（圖2）。盡管1995年化學家報(bào)道(dào)了(le)二硫代磷烷（dithiaphospholanes）可以安裝在核苷上(shàng)并與其偶聯，以合成含有二硫代磷酸酯連接結構的二核苷酸，但(dàn)是安裝硫需要單獨的氧化步驟以及有毒且不穩定（爆炸性）的試劑（圖2A）。鑒于此，作(zuò)者以去除氧化步驟和(hé)危險試劑爲目的，選擇P(V)爲中心來(lái)設計(jì)合成二硫代磷酸酯ψ2。在确定最佳離去基團與環大(dà)小(xiǎo)兩個因素後，作(zuò)者發現(xiàn)廉價的P2S5可以與五氟苯酚結合，然後用(yòng)環硫乙烷與P(V)中間體（6）進行反應，能(néng)夠大(dà)規模（>100 g）地合成含有二硫代磷酸酯結構的ψ2（3）。類似地，作(zuò)者評估了(le)近30個不同骨架以及3個不同離去基團，其中骨架優化系統地評估了(le)環大(dà)小(xiǎo)、取代基、電子效應以及立體化學對(duì)位阻、偶聯和(hé)整體穩定性的影響，并發現(xiàn)ψO是唯一可行的試劑。随後，作(zuò)者以簡單、可規模化（>50 g）的步驟合成了(le)ψO試劑（圖2A）。具體而言，廉價的P2S5與4-溴苯硫酚進行反應得到(dào)P(V)中間體（7），後者與氫化cis-檸檬烯環氧化物（8）結合生成PS試劑（9），最後經SeO2脫硫便可獲得ψO（5）。接下(xià)來(lái)，作(zuò)者将P(V)平台與目前最先進的P(III)方法進行了(le)比較（圖2B），結果顯示P(V)平台比P(III)方法步驟更簡便、産物純度更高(gāo)（>99%）且不會(huì)産生PS雜(zá)質。爲了(le)進一步測試和(hé)對(duì)比兩個平台的優缺點，作(zuò)者對(duì)混合PO-PS主鏈的合成進行了(le)探索。以P(III)方法爲例，PS二聚體（13）與PA-dT（18）發生亞磷酰胺偶聯反應得到(dào)被保護的三聚體（14），後者經氧化得到(dào)目标産物和(hé)脫硫副産物的混合物。相比之下(xià)，使用(yòng)氧化還原中性P(V)方法則能(néng)夠成功地制備未保護的混合PS-PO三聚體（19），同時(shí)沒有任何硫損失。
這(zhè)種P(V)方法要面臨的另一個大(dà)挑戰是能(néng)否克服經典P(V)試劑較慢的偶聯速率問題，以适應傳統的自(zì)動化寡核苷酸合成方案。作(zuò)者基于P(V)全套試劑，采用(yòng)動力學研究評估了(le)P(V)平台的偶聯性能(néng)，結果顯示經典的基于P(V)的磷酸三酯方法非常緩慢（圖2C，橙色條），而本文(wén)詳述的P(V)試劑平台與行業标準P(III)方案的性能(néng)相同，所有反應均在兩分鐘(zhōng)内達到(dào)完全轉化。在過去的30多年裏，基于亞磷酰胺合成的SPOS方法得到(dào)了(le)不斷優化。盡管其中一些(xiē)方法或許也(yě)可繼續使用(yòng)，但(dàn)在某些(xiē)方面現(xiàn)有解決方案與P(V)合成方法并不兼容（圖3A）。目前，通用(yòng)的載體對(duì)于1,8-二氮雜(zá)雙環[5.4.0]十一碳-7-烯（DBU）不夠穩定，爲此作(zuò)者使用(yòng) Pya 保護基代替标準的酰胺保護基，開(kāi)發了(le)一種穩定性顯著改善的通用(yòng)載體（20，圖3B）。同時(shí)，當對(duì)胸苷使用(yòng)Pom保護時(shí)，也(yě)獲得了(le)更好(hǎo)的結果。其次，作(zuò)者在确定所有P(V)試劑的化學選擇性和(hé)相對(duì)偶聯速率後，對(duì)氧化還原中性P(V)平台在自(zì)動化 SPOS 上(shàng)的效率進行了(le)系統的研究。第一步，樹脂結合核苷的DMT基團去保護得到(dào)遊離的5ʹ-醇，後者與P(V)的核苷酸進行反應，随後發生封蓋和(hé)解封步驟完成了(le)固相循環，并爲下(xià)一次偶聯奠定了(le)基礎。
接下(xià)來(lái)就是合成的實戰檢驗。任何新試劑系統要用(yòng)于寡核苷酸合成平台，必須先證明(míng)在使用(yòng)單一方案制備不同序列的情況下(xià)仍能(néng)保持高(gāo)保真度和(hé)穩健性。爲了(le)檢驗新P(V)平台的成色，作(zuò)者設計(jì)了(le)一種寡核苷酸分子結構“矩陣”，以将所有可能(néng)的核堿基（A、C、G、T）和(hé)糖（DNA和(hé)LNA）組合引入到(dào)3-10-3 DNA/LNA gapmer框架上(shàng)，這(zhè)也(yě)是目前RNase H激活反義寡核苷酸中最先進的技術（圖3C）。無論P(V)單體是用(yòng)于評估該方法的通用(yòng)性還是用(yòng)于序列特異性優化，作(zuò)者使用(yòng)的均是單一方案。首先，作(zuò)者測試了(le)這(zhè)種方法的通用(yòng)性，合成了(le)具有交替（21, 22）和(hé)連續立體化學結構（23-26）的均質、手性PS-ASO。值得一提的是，這(zhè)種使用(yòng)氧化還原中性P(V)基試劑的方法是第二個工(gōng)業上(shàng)可行的生産立體純PS-ASO的平台。随着這(zhè)一重要目标的達成，作(zuò)者開(kāi)始将 PO2 連接結構引入這(zhè)些(xiē)分子結構中，以高(gāo)純度獲得了(le)嵌合序列（27-30），合成過程中硫沒有實質性的損失。接下(xià)來(lái)，作(zuò)者制備了(le)同時(shí)帶有PS和(hé) PS2連接結構（31-34）的寡核苷酸序列以及含有所有四種可能(néng)連接結構的寡核苷酸序列（35, 36）。最後，爲了(le)證明(míng)這(zhè)種P(V)寡核苷酸合成平台的優勢，作(zuò)者基于ψ 的衍生物rac-ψ（圖1），在該平台上(shàng)合成了(le)外(wài)消旋PS寡核苷酸（37、38）（圖3D）。寡核苷酸療法能(néng)夠直接調控基因表達，被認爲是繼小(xiǎo)分子藥物和(hé)蛋白(bái)質類藥物之後的新一類藥物開(kāi)發熱點方向。迄今爲止，已被研究的寡核苷酸修飾數量十分有限，在臨床中的應用(yòng)甚至更少，說到(dào)底，原因還是在于合成水(shuǐ)平跟不上(shàng)。基于P(V)試劑合成寡核苷酸早已有之，但(dàn)由于化學選擇性低(dī)及反應性差等問題而無法擔當大(dà)任。Baran教授等人的這(zhè)項工(gōng)作(zuò)可以說使P(V)策略煥發新生，讓人們獲得希望的寡核苷酸嵌合序列成爲可能(néng)。更有意義的是，這(zhè)一P(V)平台兼容商用(yòng)的寡核苷酸自(zì)動化固相合成系統，應用(yòng)前景光明(míng)。盡管該平台分離收率（12-27%）還不算(suàn)太高(gāo)，但(dàn)經過一定的優化，未來(lái)應該也(yě)不會(huì)是太大(dà)問題，即便在現(xiàn)在，這(zhè)個水(shuǐ)平的收率也(yě)足以支持藥物化學的實驗室研究。
