全球約有2.9億慢性乙型肝炎病毒感染者，現(xiàn)有核苷（酸）類似物和(hé)幹擾素類藥物因長期甚至終生用(yòng)藥或耐受性問題，以及極少能(néng)實現(xiàn)現(xiàn)階段的功能(néng)性治愈目标而無法滿足臨床需求，急需開(kāi)發新型作(zuò)用(yòng)機制藥物。
現(xiàn)今有多種針對(duì)慢乙肝治療的新型作(zuò)用(yòng)機制藥物正在進行臨床開(kāi)發，包括病毒進入抑制劑、聚合酶抑制劑、RNA沉默療法、衣殼組裝調節劑、病毒蛋白(bái)轉運抑制劑、法尼醇X受體激動劑（FXR）、治療性疫苗、基因編輯技術等等。
其中RNA沉默（RNAi）療法是上(shàng)述諸多療法中較早開(kāi)發并表現(xiàn)出有希望臨床結果的一種療法。RNAi 涉及使用(yòng)同源核苷酸鏈來(lái)靶向轉錄後 HBV mRNA，從(cóng)而抑制下(xià)遊病毒蛋白(bái)産生。RNAi 可以将 HBsAg 抑制到(dào)低(dī)水(shuǐ)平，這(zhè)是預測 HBsAg 血清清除的重要替代結果。通過 RNAi 減少 HBsAg，T 細胞功能(néng)可能(néng)被逆轉和(hé)實現(xiàn)宿主免疫反應的重建。
香港大(dà)學醫(yī)學院 Man-Fung Yuen 團隊近日發表了(le)一份關于 RNAi 做爲一種新型療法用(yòng)于慢乙肝研究的綜述，在該綜述中研究人員對(duì) RNAi用(yòng)于慢乙肝治療的機制和(hé)證據進行了(le)回顧。略曉薛節選了(le)該綜述的部分内容與各位共享，以下(xià)是内容詳情
RNA幹擾（RNAi）
RNAi作(zuò)用(yòng)機制
RNA幹擾（RNA interference, RNAi）是指在進化過程中高(gāo)度保守的、由雙鏈RNA（dsRNA）誘發的、同源mRNA高(gāo)效特異性降解的現(xiàn)象。1998年，Fire等證實Guo等人發現(xiàn)的正義RNA抑制同源基因表達的現(xiàn)象是由于體外(wài)轉錄制備的RNA中污染了(le)微量非編碼雙鏈 RNA（dsRNA）而引發，這(zhè)種非編碼雙鏈 RNA 被命名爲小(xiǎo)幹擾 RNA (siRNA)，并将這(zhè)一現(xiàn)象命名爲RNAi。
siRNA包含正義鏈和(hé)反義鏈，反義鏈與靶mRNA互補。siRNA通過胞吞作(zuò)用(yòng)進入細胞質，後與Dicer（RNase III核酸内切酶）、Argonaute（RNase）和(hé)反式激活效應元件RNA-結合蛋白(bái)（RNA-binding cofactor）相互作(zuò)用(yòng)，形成RISC(RNA誘導沉默複合體)複合物（RLC)，并進一步形成可以與 siRNA 引導鏈具有互補序列的靶 mRNA 結合的 RISC。RISC與靶 mRNA 結合後，RISC 通過多種機制誘導基因沉默，這(zhè)些(xiē)機制可能(néng)因生物體而異。
RNAi做爲一種療法用(yòng)于病毒性感染疾病
2018年美(měi)國FDA批準了(le)靶向遺傳性轉甲狀腺素蛋白(bái)澱粉樣變性的首款 siRNA 療法 Patisiran 上(shàng)市，此後，siRNA 療法領域迅速擴大(dà)。目前正在研究其在多種疾病中的應用(yòng)，包括病毒感染、遺傳病、心力衰竭、慢性腎病和(hé)惡性腫瘤等。
目前，siRNA 被研究用(yòng)于目前治療無法消除的慢性病毒感染，例如慢性乙型肝炎和(hé)人類免疫缺陷病毒 (HIV) 感染，以及一些(xiē)沒有有效治療方法的病毒性感染，如呼吸道(dào)合胞病毒、脊髓灰質炎病毒、和(hé)埃博拉病毒。
開(kāi)發 siRNA 抗病毒藥物的一個關鍵考慮因素是适當的序列選擇。選擇的 RNA 序列應該對(duì)目标病毒基因組中的保守序列具有高(gāo)度特異性，這(zhè)樣才能(néng)發揮泛基因型抗病毒作(zuò)用(yòng)。特定的 siRNA 序列還可以減少對(duì)宿主基因組的脫靶效應，從(cóng)而避免不良藥物毒性。siRNA 一般長約 21 -23bp，其中 3' 端有兩個核苷酸突出，因爲較長的序列會(huì)增加脫靶效應的風(fēng)險。
結構優化對(duì)于 siRNA 抗病毒藥物至關重要。由于天然存在的核酸酶，未修飾的 siRNA 在人血清中迅速分解。此外(wài)，由于磷酸鹽骨架和(hé)陰離子電荷的存在，未修飾的 siRNA 是親水(shuǐ)的，不能(néng)通過帶負電荷的細胞膜擴散。最後，siRNA 具有免疫刺激作(zuò)用(yòng)，并且可以通過雙鏈 RNA 依賴性蛋白(bái)激酶和(hé) Toll 樣受體誘導不需要的非特異性幹擾素反應。
siRNA 磷酸骨架的化學修飾可以解決 siRNA 不穩定性、細胞進入和(hé)意外(wài)免疫激活這(zhè)三個挑戰。通過在磷酸骨架上(shàng)用(yòng) 2'-O-甲基或 2'-F-核苷酸取代 2'-OH 基團，可以保護 siRNA 免受血清核酸酶的影響，減少脫靶效應，最大(dà)化減少不需要的免疫刺激反應，同時(shí)，效力提高(gāo)了(le) 500 倍。
目前已經研究了(le)病毒和(hé)非病毒載體将 siRNA 攜帶到(dào)靶細胞中，非病毒載體包括聚合物、适體、肽、 脂質體、抗體和(hé)脂質納米顆粒，腺病毒載體是最常用(yòng)的病毒載體，因它無毒、易于生産，并且在疫苗中的應用(yòng)有足夠的經驗。此外(wài)，遞送系統的選擇還取決于所需的 siRNA 靶标。例如，N-乙酰半乳糖胺 (GalNAc) 是肝髒導向 siRNA 的理(lǐ)想選擇，因爲 GalNAc 與去唾液酸糖蛋白(bái)受體(ASGPR)結合，而肝細胞中富含ASGPR且兼具特異性。
設計(jì)針對(duì)乙型肝炎病毒的 RNA 幹擾療法
HBV 的特征在于其四個開(kāi)放(fàng)閱讀框 (ORF)，分别編碼乙型肝炎前核心/核心、聚合酶、表面和(hé) X 蛋白(bái)。四個 ORF 具有重疊序列，并且在核心蛋白(bái)編碼區(qū)的 3' 端具有相同的多聚腺苷酸化信号。這(zhè)使得單個 siRNA 即可幹擾所有四種 HBV 轉錄物，從(cóng)而減少所有下(xià)遊病毒蛋白(bái)和(hé)前基因組 RNA 的産生。病毒複制也(yě)會(huì)被siRNA 減少，這(zhè)可能(néng)會(huì)間接減少 cccDNA 儲存庫。因此，siRNA 能(néng)夠直接或間接幹擾病毒生命周期的多個步驟。下(xià)圖描述了(le) RNAi 對(duì)抗 HBV 的機制。
在設計(jì)針對(duì) HBV 的 siRNA 時(shí)，病毒突變是一個需要考慮的問題，因爲單個堿基錯配可能(néng)導緻 siRNA 效果的喪失。據報(bào)道(dào)，在 RNA 病毒（包括 HIV和(hé)HCV）中，siRNA 處理(lǐ)後突變株迅速出現(xiàn)。然而目前還未有siRNA 誘導HBV突變的報(bào)道(dào)，但(dàn) siRNA 可以對(duì)預先存在的抗性 HBV 準種施加選擇壓力。在siRNA治療中使用(yòng)靶向功能(néng)重要和(hé)保守區(qū)域或使用(yòng)多個 siRNA 觸發器對(duì)最大(dà)限度地減少HBV突變的潛在影響至關重要。
siRNA 還可以恢複宿主對(duì) HBV 的免疫反應。HBV 持續慢性存在的一個主要因素是長期暴露于高(gāo)水(shuǐ)平的免疫抑制性病毒抗原（尤其是 HBsAg）後的宿主免疫抑制。CHB 與宿主免疫通路受損相關，包括 Toll 樣受體信号傳導、免疫檢查點信号傳導, 和(hé)增加免疫抑制性 T 調節細胞活性。這(zhè)些(xiē)作(zuò)用(yòng)最終導緻 HBV 特異性 T 細胞克隆的減少和(hé)功能(néng)障礙，導緻 T 細胞數量和(hé)功能(néng)上(shàng)的抗 HBV 缺陷。通過其在減少 HBV 病毒抗原方面的有效作(zuò)用(yòng)，siRNA 可以間接重建免疫系統。
反義寡核苷酸，基因沉默的另一種形式
首先，siRNA 是雙鏈 RNA，理(lǐ)想長度爲 21 個核苷酸加上(shàng)兩個 3' 末端突出核苷酸。相比之下(xià)，ASO 是長度爲 15 到(dào) 25 個核苷酸的單鏈 DNA。ASO 被設計(jì)爲Gapmer 結構，中央未修飾的互補 DNA 序列兩側是修飾的 RNA 樣片段。Gapmer 結構增強了(le) ASO 對(duì)其靶序列的親和(hé)力并增加了(le)其對(duì)核酸酶降解的抵抗力。
其次，未修飾的 siRNA 需要載體才能(néng)進入細胞，而未結合的 ASO 通過受體介導的途徑即可被吸收到(dào)肝細胞中。進入細胞後，siRNA 在核内體中積累，給藥頻率較少，而 ASO 在細胞質中積累，需要更頻繁的給藥。雖然 ASO 不需要與載體修飾，但(dàn) ASO 中的 GalNAc 修飾可以增強肝細胞攝取并減少全身暴露，類似于 siRNA 中 GalNAc 修飾的效果。
第三，siRNA 需要形成 RISC 才能(néng)與靶 mRNA 結合，因爲正義鏈的去除在反義鏈上(shàng)互補核苷酸的暴露中是不可或缺的，而 ASO 可以單獨與靶 mRNA 結合。
第四，siRNA和(hé)ASO具有不同的基因沉默機制。如上(shàng)所述，siRNA 通過 RISC 介導其作(zuò)用(yòng)。相比之下(xià)，ASO 最常通過在細胞質和(hé)細胞核中募集 RNase-H（核酸内切酶家族）來(lái)切割靶 RNA 來(lái)介導其作(zuò)用(yòng)。ASO 還可以通過抑制 5' 帽形成或阻斷核糖體亞基附着來(lái)抑制 RNA 翻譯。
在慢性乙型肝炎的臨床前和(hé)臨床證據
在該份綜述中研究人員對(duì)當前處在臨床前和(hé)臨床試驗階段的在研藥物研究數據進行一一描述，RNAi類藥物包括ARC-520、ARB-1467、AB-729、RG-6346(DCR HBVS)、VIR-2218（BRII-835）、JNJ-3989（ARO-HBV）、ALG-125918、ALG-125755，反義寡核苷酸 (ASO)類藥物包括RO7062931、GSK3389404、Bepirovirsen (GSK3228836，GSK836) 、ALG-020572，以及VIR-2218 的聯合用(yòng)藥、JNJ-6379的聯合用(yòng)藥、ALG-125755 (siRNA) + ALG-020572 (ASO)、 ALG-125903 (siRNA) + ALG-020579 (ASO) + ALG-010133。由于上(shàng)述藥物涉及的數據略曉薛此前在肝髒時(shí)間微信公衆号曆史内容中幾乎均有發布，在此就不再進行贅述，想查看(kàn)的朋友可自(zì)行在曆史内容中輸入相關藥物名稱進行查看(kàn)。
當前證據和(hé)結論的概述
現(xiàn)有臨床試驗一緻證實 siRNA 普遍是安全的，大(dà)多數不良事(shì)件爲輕微注射反應或流感樣症狀。ALT驟升可發生在 siRNA 治療中，但(dàn)通常短暫且與 HBsAg 降低(dī)有關，提示免疫重建和(hé)感染肝細胞的消除。
siRNA 已顯示出有效的降低(dī) HBsAg 效果。在新一代 siRNA（不包括老(lǎo)一代 ARC-520 和(hé) ARB-1467）中，HBsAg 平均降低(dī) 2 – 2.5 log 是可以實現(xiàn)的，高(gāo)劑量治療組中超過 90% 的患者達到(dào)超過 1 log IU/ml HBsAg 降低(dī)，以及 50 – 97% 的患者 HBsAg 被抑制到(dào) 100 IU/ml 以下(xià)。治療結束後 siRNA 中 HBsAg 的降低(dī)是可持續的，且 HBsAg 血清學清除的發生率已被記錄。
盡管如此，這(zhè)些(xiē)有效的 HBsAg 降低(dī)效果是否可以轉化爲持久的 HBsAg 血清學清除仍不清楚。此外(wài)，需要比較 HBeAg 陽性和(hé)陰性患者的更大(dà)規模研究來(lái)确定藥物作(zuò)用(yòng)是否可推廣到(dào)不同的 CHB 亞組。當前來(lái)自(zì)不同 CHB 人群的試驗的長期數據備受期待。
目前 siRNA 的标準給藥方案爲多次給藥，因多次給藥比單次給藥更能(néng)降低(dī) HBsAg 且效果更持久。目前的證據支持 siRNA 可每月給藥一次，AB-729 甚至在間隔 8 或 12 周用(yòng)藥一次顯示出有效的給藥效果。
siRNA 的總給藥持續時(shí)間（總療程）當前仍不太明(míng)确，因爲在當前試驗中采用(yòng)了(le)不同的治療持續時(shí)間（從(cóng)兩個月到(dào)一年不等）。理(lǐ)想治療持續時(shí)間的決定可能(néng)取決于治療後 HBsAg 抑制的持久性，并且需要更長的随訪試驗來(lái)監測 HBsAg 血清學清除。這(zhè)些(xiē)問題對(duì) RNAi 療法的未來(lái)發展具有重要意義。
與 siRNA 類似，ASO 也(yě)普遍安全且耐受性良好(hǎo)。雖然 siRNA 可每月給藥一次，但(dàn) ASO 需要更頻繁的給藥（每周或每兩周一次），這(zhè)反映了(le) siRNA 和(hé) ASO 之間固有的藥代動力學差異。
在決定是否有必要将 RNAi 與其他(tā)新型抗病毒藥物結合以在所有患者中實現(xiàn)功能(néng)性治愈之前，需要确定通過 RNAi 達到(dào)低(dī) HBsAg 水(shuǐ)平（例如 <100 IU/mL）的患者随後 HBsAg 血清學清除的可能(néng)性。如果停止 RNAi 後短時(shí)間内 HBsAg 血清清除率相當高(gāo)，可能(néng)不需要将 RNAi 與其他(tā)不同類别的新藥結合使用(yòng)。然而，對(duì)于仍然具有高(gāo) HBsAg 水(shuǐ)平的患者，可能(néng)需要聯合治療。
随着 NA 的既定功效和(hé)安全性，未來(lái)的 RNAi 治療方案可能(néng)會(huì)聯合 NA 做爲基石。在 RNAi 和(hé) NA 中添加第三種抗 HBV 藥物可能(néng)會(huì)産生協同抗病毒作(zuò)用(yòng)。
由于 RNAi 具有免疫重建的潛在作(zuò)用(yòng)，免疫調節劑的添加可能(néng)會(huì)進一步增強宿主的抗病毒免疫系統。事(shì)實上(shàng)，将 VIR-2218 和(hé)聚乙二醇化幹擾素 α-2a 結合使用(yòng)比單獨使用(yòng)任何一種藥物都能(néng)産生更大(dà)的 HBsAg 抑制。目前的數據表明(míng)，将 siRNA 與幹擾素結合可以産生協同效應。
盡管如此，siRNA 與免疫調節劑（包括 siRNA + 治療性疫苗和(hé) siRNA + Toll 樣受體激動劑）的其他(tā)組合方案仍在進行臨床試驗研究。将 siRNA 與新型病毒靶向制劑聯合用(yòng)藥的研究也(yě)在進行。
值得注意的是，臨床前實驗證明(míng)了(le)将 siRNA 和(hé) ASO 這(zhè)兩種共享相同靶标 (mRNA) 的 RNA 沉默劑結合時(shí)具有協同效應，盡管這(zhè)種組合的潛在機制和(hé)臨床療效尚未确定。
另一方面，siRNA 和(hé)衣殼組裝調節劑的組合在正在進行的試驗中未能(néng)産生協同效應。這(zhè)凸顯了(le)仔細選擇與 siRNA 組合藥物的必要性，一系列涉及具有不同機制的藥物的組合試驗仍在進行中。
總而言之，RNAi 是一種安全的技術，可以誘導有效和(hé)可持續的 HBsAg 抑制。RNAi 的研究正在迅速發展，早期數據很(hěn)有希望。多項試驗正在進行中，随着進一步的發展，RNAi 可能(néng)會(huì)成爲一種改變 CHB 治療範式的新型治療策略。
參考文(wén)獻：RNA interference as a novel treatment strategy for chronic hepatitis B infection